革蘭氏染色的注意事項
注意事項
1、選用活躍生長期菌種染色,老齡的革蘭氏陽性細菌會被染成紅色而造成假陰性。
2、塗片不宜過厚,以免脱色不完全造成假陽性。
3、脱色是革蘭氏染色是否成功的關鍵,脱色不夠造成假陽性,脱色過度造成假陰性。
實驗流程
1、取載玻片用紗布擦乾,載玻片的一面用馬克筆畫一個小圈(用來大致確定菌液滴的位置)。塗菌的部位在火焰上烤一下,除去油脂。
2、塗片
液體培養基:左手持菌液試管,在酒精燈火焰附近5釐米左右打開管蓋;右手持接種環在火焰中燒灼滅菌,等冷卻後從試管中沾取菌液一環,在潔淨無脂的載玻片上塗直徑2毫米左右的塗膜,最後將接種環在火焰上燒灼滅菌。
固體培養基:先在載玻片上滴一滴無菌水,再用接種環取少量菌體,塗在載玻片上,使其薄而均勻。
3、晾乾:讓塗片在空氣中自然乾燥。
4、固定:讓菌膜朝上,通過火焰2-3次固定(以不燙手為宜)。
5、染色:將固定過的塗片放報紙上,滴加草酸銨結晶紫液,染1分鐘。
6、水洗:用水緩慢沖洗塗片上的染色液,用吸水紙吸乾。簡單染色結束可觀察細胞形態。
7、媒染:滴加1滴碘液,染1分鐘,水洗。
8、脱色:吸去殘留水,連續滴加95%乙醇脱色20-30秒至流出液無紫色,立即水洗。
9、復染:滴加蕃紅復染3-5分鐘,水洗。至此,革蘭氏染色結束。
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