引物設計原則
什麼是引物設計原則,一起來看看小編今天的分享吧。
1、引物長度一般爲15-30bp,常用的爲18-27bp,但不能大於38bp。
2、引物GC含量一般爲40%-60%,以45-55%爲宜,上下游引物GC含量和Tm值要保持接近。
3、引物所對應的模板序列的Tm值最好在72℃左右,至少要在55-80℃之間,Tm值曲線以選取72度附近爲佳,5'到 3’的下降形狀也有利於引物與模板的結合。
4、ΔG值(自由能)反應了引物與模板結合的強弱程度,3'端的ΔG值相對要低,且絕對值不要超過9,否則不利於正確引發反應,3'末端雙鏈的ΔG值在0--2kcal/mol時,PCR產量幾乎達到百分之百,但在-6時只達到40%,-8時少於20%,-10時接近於0。
5、錯配率一般不要超過100,否則會出現非目的條帶。但對於某些特定的模板序列,還應結合比較其在正確位點的引發效率。如果兩者相差很大,比如在正確位點的引發效率爲340以上,而在錯誤位點的引發效率爲110,並且不好找到其他更合適的引物,那麼這對引物是可以接受的。
6、Frq曲線爲Oligo6軟件新引進的一個指標,解釋了序列片段存在的重複機率大小,選取引物時,應該用Frq值相對較低的片段。
7、引物二聚體及髮卡結構的能量的絕對值一般不要超過4.5,否則容易產生引物二聚體而且會降低引物濃度從而導致PCR不能正常發生。
8、3'端最好不要是連續鹼基,GGG或CCC會導致錯誤的引發,同時3'端最後一個鹼基最好不要是A或T,若是,會導致錯配。
9、以公式Tm=4*(G+C)+2*(A+T)-5計算Tm值,也就是退火溫度。選擇較低Tm值的引物的退火溫度爲反應的退火溫度,最好保證每個引物的Tm值相匹配,且在70-75℃範圍內。
10、模板與穩定性較小的引物之間的Tm的差異越小,PCR的效率越高。因爲解鏈溫度也取決於它的長度,如果期待的產物長度等於或小於500bp,選用端的引物(16-18bp),如果產物長5kb,則用24bp的引物。
11、在DNA測序和PCR中最好用5'末端穩定(GC含量多),而3'端不穩定(AT含量多)的引物,這種引物的結構可以有效地消除假引發反應。
12、引物和產物之間的Tm值相差別太大,20攝氏度範圍內最好。
13、對引物的修飾一般在5'端進行,例如加酶切位點,加酶切位點的同時要根據需要添加保護鹼基。
-
銀杏葉爲什麼變黃
樹蟲害導致銀杏葉變黃的主要害蟲是茶黃薊馬,屬纓翅目薊馬科,主要用它的矬吸式口器吸食葉片汁液。銀杏葉在4-9月都有可能受到蟲害威脅。一般受茶黃薊馬吸食後葉片從銀白色斑點連片成黃褐色病斑,葉片呈現褶皺狀,嚴重時可導致銀杏葉早期落葉。一旦銀杏葉患蟲害病要及...
-
讓人瞬間心疼的句子
1、愛那麼短,遺忘那麼長。2、朝春盡紅顏老,花落人亡兩不知!3、我的翅膀,被一滴淚燙傷,飛不到天堂。4、我以爲我們回到曾經了原來只是形同陌路了5、愛上你不是錯,錯的是,我沒讓你愛上我。6、用淚水凝成愛的湖泊,用愛劃一道幸福的圈。7、只要這個世界,你還是我的,那麼依舊...
-
黃桃怎麼保存,黃桃的保存方法介紹
1、新鮮的黃桃連同外包裝一起放進冰箱的冷藏箱內或者保鮮箱內,注意不能清洗,不能用塑料袋封口,一般可以存放7-15天。2、如果一下子購買太多的黃桃,且黃桃太成熟,果肉太軟的情況下,也可以製作成黃桃果醬保存。3、將黃桃清洗乾淨後去皮去核,將黃桃果肉放在淡鹽水中浸泡5...
-
波士頓龍蝦處理,波士頓龍蝦處理的方法
1、波士頓龍蝦的處理方法:從背面握住龍蝦,注意不要被龍蝦的腳刺傷。把龍蝦腹部朝外,用一根筷子從龍蝦的排尿口插入至接近頭部處。取出筷子,將龍蝦的殘留尿液排除乾淨。這時龍蝦就不動了。2、握住龍蝦殼的一端,就可以非常輕易地先卸下大螯,翻開頭部的蓋子。清理取出龍...