培養基的配製方法
1、配製用水
培養基的大部分是水,所以水的質量直接影響培養基的質量。按Waymouth標準,水的電阻應爲200萬歐姆,一般實驗室裏以玻璃蒸餾器製備的
雙蒸水或三蒸水可以符合使用條件。
2、培養基
培養基有天然、人工兩種。一般實驗室使用的是RPMI-1640粉末培養基,以雙蒸或三蒸水配製。NaHCO3(或HCl)調pH至7.2-7.4,若pH值超過7.6或遠低於6.8,則大多數細胞不能生長。RPMI-1640不耐高壓滅菌,使用前需經滅菌0.22μm孔徑濾膜濾過處理。
3、血清
培養中常使用小牛血清(或胎牛血清)。血清亦不能高壓滅菌,無菌的小牛血清需在56℃水浴30分鐘滅活補體,置4℃冰箱存放待用。配製時含量視培養細胞種類、時間而定,一般用10—15%。由於血清成分複雜、條件不易控制,可選用無血清培養基。
4、抗菌素
爲防止培養時期細菌的污染,可在培養基中添加適當抗菌素,一般用量與組織細胞培養相同:卡那黴素100單位/毫升,或雙抗--青黴素100單位/毫升,鏈黴素100微克/毫升。
5、植物血凝素(PHA)
非增殖期的細胞不能製備染色體,如人外周血淋巴細胞,但在離體培養過程中,在PHA的作用下,可被刺激轉化爲淋巴母細胞而進入有絲分裂。
經實驗測定其分裂高峯分別於培養後44-48小時和68-72小時。
PHA有粘多糖,蛋白質兩種重要成分。粘多糖促使有絲分裂,蛋白質起凝集作用。PHA激活的細胞數隨其濃度而增加,直至全部免疫活性細胞均
被激活爲止,但PHA濃度過高會引起凝集,一般採用4%濃度爲好。
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